前言本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部科技教育司提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所、
前?言
本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部科技教育司提出。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所、農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：彭于發(fā)、王錫鋒、李寧、張大兵、羅云波、黃昆侖、汪其懷、賈士榮。
本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。
轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測?通用要求
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測的通用要求及轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測實(shí)驗(yàn)室的操作規(guī)范。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適合于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T15481-2000?檢測和檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求
GB/T6682?分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
NY/T673?轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測?抽樣
NY/T674?轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測?DNA提取和純化
NY/T675?轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測?大豆PCR方法
3術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1?一般術(shù)語?General?terms
3.1.1?轉(zhuǎn)基因生物?genetically?modified?organism?(GMO)
通過基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物。包括轉(zhuǎn)基因植物、動(dòng)物和微生物。
3.1.2?轉(zhuǎn)基因植物?genetically?modified?plant?organism?(GMP),?transgenic?plant?
通過基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的植物，是轉(zhuǎn)基因生物的一類。
3.1.3?定性檢測極限?detection?limit
以轉(zhuǎn)基因生物（如種子）提取的DNA或標(biāo)準(zhǔn)雙鏈DNA分子作為PCR反應(yīng)的模板，所能檢測到的脫氧核糖核酸（DNA）的極限（需要確保陽性樣品的純度，才能達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的靈敏度）。
3.2?與DNA提取和純化相關(guān)的術(shù)語?Terms?relative?to?extraction?and?purification?of?DNA
3.2.1?DNA提取?DNA?extraction
將DNA從一個(gè)樣品的多種組分中分離出來。
3.2.2?DNA純化?DNA?purification
獲得不含PCR反應(yīng)抑制因子的DNA。
3.3?與DNA擴(kuò)增和PCR技術(shù)相關(guān)的術(shù)語?Terms?relative?to?DNA?amplification?and?to?the?PCR?technique
3.3.1?DNA擴(kuò)增?DNA?amplification
體外放大DNA分子拷貝數(shù)的生物學(xué)方法，如PCR。?
3.3.2?擴(kuò)增子?amplicon
由PCR等DNA擴(kuò)增方法產(chǎn)生的DNA片段。
3.3.3?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）polymerase?chain?reaction，?
模板DNA經(jīng)高溫變性為單鏈，在DNA聚合酶和適宜溫度下，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四種dNTP?（deoxyribonucleoside?triphosphate，脫氧核苷三磷酸）為底物，使退火引物延伸從而合成DNA，如此變性、退火和合成DNA反復(fù)循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。
3.3.4?引物?primer
一定長度和順序的寡核苷酸鏈。
3.3.5?篩查檢測法?detection?by?screening
用多種轉(zhuǎn)基因植物共有的標(biāo)記基因、表達(dá)調(diào)控序列等通用元件對被檢產(chǎn)品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行PCR檢測的方法。
3.3.6?身份檢測法?detection?by?identification
與標(biāo)準(zhǔn)品比較確定GMO身份的檢測方法。
3.3.7?靶序列(目的DNA)?target?sequence?(target?DNA)
PCR反應(yīng)中檢測特異性擴(kuò)增的DNA序列。
3.3.8?旁鄰片段?(邊界序列)?border?fragment?(border?region,?border?sequence)
插入在染色體上的外源基因序列和宿主生物基因組片段連接的DNA片段。
3.3.9?終點(diǎn)法分析?endpoint?analysis
一種定性、定量的分析方法，如ELISA-PCR，可對PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子進(jìn)行定性和定量分析。
3.3.10?實(shí)時(shí)分析?real-time?analysis
一種貫串PCR反應(yīng)過程，對PCR擴(kuò)增效率、擴(kuò)增情況及數(shù)據(jù)進(jìn)行監(jiān)控的定量PCR分析方法，如熒光探針的雜交過程的監(jiān)控。
3.3.11?連接片段?junction?fragment
兩個(gè)不同功能基因序列之間的連接序列或片段。
3.4?與對照相關(guān)的術(shù)語?Terms?relative?to?controls
3.4.1?GMO陽性對照?GMO?positive?control
用于PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)目的DNA或轉(zhuǎn)基因植物源材料的DNA分子。
3.4.2?GMO陰性對照?GMO?negative?control
用于PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)非轉(zhuǎn)基因植物材料的DNA分子。
3.4.3?PCR內(nèi)部對照?PCR?internal?control
加入一種無關(guān)的DNA序列到純化DNA的樣品中，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測是否存在PCR反應(yīng)的抑制物質(zhì)。
3.4.4?陽性PCR對照?positive?PCR?control
用含有目的序列的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3.4.5?陰性PCR對照?negative?PCR?control
用不含有目的序列的樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
3.4.6?PCR空白對照?PCR?blank,?negative?reagent?control
以水或不含目的DNA試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證PCR反應(yīng)過程中不被污染。
3.4.7?陰性假定對照?negative?premise?control
在樣品檢測整個(gè)操作過程中，敞開PCR反應(yīng)體系，以證明檢測的操作環(huán)境中不含有目的基因片段的污染。
3.4.8?陰性提取對照?negative?extraction?control
以水作為材料提取DNA，以證明DNA的抽提和制備過程中是否發(fā)生污染。
3.5?與探針相關(guān)的術(shù)語?Terms?relative?to?probes
3.5.1?探針?probe
在引物之間的與目的片段特異性雜交的15—30bp寡核鼓苷酸鏈.
3.5.2?內(nèi)部探針?internal?probe
標(biāo)記的內(nèi)部探針。
3.5.3?內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（內(nèi)源參照基因）?endogenous?reference?gene
具有植物物種專一性且拷貝數(shù)恒定、不顯示等位基因變化的保守DNA序列?？捎糜趯蚪M中某一目的基因進(jìn)行定量分析和驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系中是否存在抑制物質(zhì)。
4原則
轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的定性和定量PCR檢測通常包括四個(gè)步驟：
――抽樣
在一批物品中抽取具有代表性的材料，用于檢測分析。
――樣品DNA提取和純化
樣品DNA提取和純化一般包括樣品組織破碎、DNA釋放和DNA從其他化合物中純化等幾個(gè)步驟。
――DNA擴(kuò)增
對目的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
――結(jié)果分析
對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性或定量分析，確定試驗(yàn)樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分或確定轉(zhuǎn)基因成分的含量。
5?實(shí)驗(yàn)室通用要求
5.1?一般要求
轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室一般要求按GB/T15481執(zhí)行。
5.2?特殊要求
轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)區(qū)：
5.2.1?前PCR區(qū)
前PCR區(qū)專門用于準(zhǔn)備各種PCR反應(yīng)體系，此區(qū)域必須保持清潔干凈，而且沒有來自分子克隆和樣品準(zhǔn)備的污染源，前PCR區(qū)的試劑、設(shè)備和正壓活塞式移液器必須是專用的。
5.2.2?樣品準(zhǔn)備區(qū)
樣品準(zhǔn)備區(qū)專門用于樣品的制備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)采取以下預(yù)防措施：
a)?PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增的序列的DNA克隆不在該區(qū)域進(jìn)行；
b)?檢測的樣品都帶入樣品準(zhǔn)備間處理，根據(jù)需要提取DNA；
c)?DNA樣品用專門防護(hù)或正壓活塞式移液器操作，防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留；
d)?大體積樣品用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。
任何時(shí)候都穿實(shí)驗(yàn)服和戴手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在提取DNA過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
5.2.3?PCR區(qū)
PCR區(qū)專門用于PCR反應(yīng)和反應(yīng)后樣品的處理，該區(qū)使用的所有試劑、一次性器材和儀器都是專用的。由于PCR實(shí)驗(yàn)室所遇到的主要污染源是前一次PCR過程的產(chǎn)物，因此前PCR區(qū)和PCR區(qū)之間試劑和人員不能混雜，實(shí)驗(yàn)室的交通方向是單向的，永遠(yuǎn)從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”。
6?試劑
6.1?通用要求
6.1.1?用水應(yīng)符合GB6682中一級水的規(guī)格。
6.1.2?所有化學(xué)試劑如果沒有特別說明，應(yīng)沒有DNA和核酸酶的污染，應(yīng)不含PCR抑制劑。
6.1.3?所有試劑應(yīng)按照shuomingshu要求進(jìn)行保存。
6.2?DNA提取和純化試劑
按NY/T674執(zhí)行。
6.3?DNA擴(kuò)增試劑
按NY/T675執(zhí)行。
7?儀器和設(shè)備
通用設(shè)備按GB/T15481-2000執(zhí)行
所有儀器設(shè)備應(yīng)避免植物DNA和核酸酶的污染。
所有儀器設(shè)備，尤其取樣器等與試驗(yàn)樣品接觸的器具，應(yīng)清潔、不對樣品造成污染。
盛裝樣品的容器或包裝袋應(yīng)為一次性使用的，以避免交叉污染。
8?操作程序
8.1?通用要求
應(yīng)設(shè)可以檢測或分析下列情況的對照：
――假陽性；
――假陰性；
――存在干擾分析的物質(zhì)；
――分析物質(zhì)降解；
――降低檢測方法的靈敏度；
――降低分析物質(zhì)回收率。
8.2?抽樣
按照NY/T673的方法抽樣。
抽取的樣品應(yīng)具有代表性。
取樣過程中應(yīng)避免樣品散落，防止轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品擴(kuò)散。
8.3?實(shí)驗(yàn)室樣品和試驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備與儲(chǔ)存
樣品的制備方法視樣品的狀態(tài)和特性而定。固態(tài)樣品的制備宜先粉碎至滿足DNA提取的技術(shù)要求，或用液氮研磨至DNA充分釋放并滿足DNA抽提的技術(shù)要求。液態(tài)樣品的制備宜用緩沖液或水充分洗滌，直至其中的DNA完全溶于緩沖液或水中為止。
在接收時(shí)應(yīng)注明并記錄樣品重量、生產(chǎn)和包裝條件。
樣品在測試前后應(yīng)放置在密閉的容器內(nèi)，防止交互污染。
樣品應(yīng)在保持組分不發(fā)生變化的條件下儲(chǔ)存。
易腐爛的樣品在分析前應(yīng)根據(jù)需要在4℃、-20℃或-80℃儲(chǔ)存，如有特殊需要應(yīng)在無氧條件下儲(chǔ)存。
應(yīng)記載儲(chǔ)藏條件和時(shí)間。
存查樣品應(yīng)妥善保存3個(gè)月。檢測為GMO的樣品應(yīng)妥善保存6個(gè)月，以備復(fù)驗(yàn)。保存期滿后，需經(jīng)無害化處理。
8.4?DNA提取和純化
DNA提取和純化按照NY/T674的方法。
8.5?定性PCR檢測
定性PCR檢測按照我國或國際認(rèn)可的方法。
定性PCR檢測對象包括轉(zhuǎn)基因的目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等外源基因和元件。檢測時(shí)應(yīng)設(shè)陽性對照、陰性對照、試劑空白對照和提取空白對照，同時(shí)應(yīng)檢測內(nèi)源基因。
8.6?以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測
以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測按照我國或國際認(rèn)可的方法。
9?通用質(zhì)量保證措施
檢測物品的處置按GB/T15481執(zhí)行。
檢測結(jié)果質(zhì)量的保證按GB/T15481-2000中的5.9執(zhí)行。
10?結(jié)果分析與表述
10.1?通用要求
檢測結(jié)果不宜表述為分析樣品不含轉(zhuǎn)基因生物。
10.2?結(jié)果分析
10.2.1?通用要求
以下情況認(rèn)為樣品含有轉(zhuǎn)基因植物DNA：
――擴(kuò)增片段的特異性通過酶切圖譜、測序、Southern雜交、PCR-ELISA、點(diǎn)雜交或?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證。用上述方法該特異性未發(fā)生改變，片段大小也一致，而且與陽性對照相同，不含GMO的非GMO對照不存在任何相似大小的擴(kuò)增片段。
――所有對照和標(biāo)準(zhǔn)品都顯示正常結(jié)果。
2個(gè)平行樣品的檢測結(jié)果應(yīng)一致。出現(xiàn)不一致的，應(yīng)重做2個(gè)平行樣品，最終結(jié)果以多數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。
10.2.2?定性PCR檢測結(jié)果的表述
10.2.2.1?在模板DNA的量超過被測物種基因組（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結(jié)果：
――對于陰性結(jié)果：“該樣品未檢出×××基因”；
――對于陽性結(jié)果：“該樣品檢出×××基因”。
10.2.2.2?在模板DNA的量低于被測物種基因組（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因）DNA量20000倍的情況下，按下列方式表述結(jié)果：
――對于陰性結(jié)果：“該樣品中DNA含量不足，建議對樣品做定量分析以確定所用檢測方法的靈敏度”；
――對于陽性結(jié)果：“該樣品檢出×××基因”。
11?檢驗(yàn)報(bào)告
檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列內(nèi)容：
――鑒定樣品所需的所有信息；
――引用的標(biāo)準(zhǔn)和方法，并說明是定性還是定量方法及靈敏度；
――應(yīng)用哪種定量方法（終點(diǎn)法或?qū)崟r(shí)PCR）；
――接收樣品和分析樣品的大?。?/span>
――樣品的接收日期；
――樣品的分析日期；
――測試樣品的大??；
――檢測結(jié)果；
――測試中觀察到的任何特殊情況；
――對結(jié)果可能產(chǎn)生影響的任何其他異常情況。
